發(fā)布時間：2024年09月19日
Maurice產(chǎn)品摘要
Maurice簡介
通過對傳統(tǒng)毛細管電泳技術的創(chuàng)新，Maurice可以對蛋白產(chǎn)品進行全自動分子量異質(zhì)性及電荷異質(zhì)性分析。您的mAb，ADC，疫苗或病毒樣顆粒需要cIEF和CE-SDS數(shù)據(jù)嗎?Maurice可以幫助您實現(xiàn)這一切。只需安裝一個預裝的卡盒，放入樣品瓶或96孔板，然后點擊開始。您將在一天內(nèi)完成方法開發(fā)，并在幾分鐘內(nèi)獲得高分辨率，可重現(xiàn)的數(shù)據(jù)。
Maurice系列有三款型號，包括獨立進行十二烷基硫酸鈉毛細管電泳(CE-SDS)的Maurice S、獨立進行毛細管等電聚焦(cIEF)的Maurice C，以及可切換運行上述兩種功能的Maurice。
Maurice 特點
CE-SDS是蛋白類生物制品(單克隆抗體藥物分子、體外診斷原料、酶制劑，重組蛋白等)分子量大小、純度分析的手段。中國國家藥典2015有明確CE-SDS方法學規(guī)定：采用十二烷基硫酸鈉毛細管電泳(CE-SDS)紫外檢測方法，在還原和非還原條件下，依據(jù)分子量大小，定量測定重組單抗產(chǎn)品的純度。
和傳統(tǒng)CE-SDS方法相比，Maurice S創(chuàng)新采用即插即用(Ready-to-go)的免組裝毛細管卡盒，無需額外管路系統(tǒng)，方便維護，流程簡化，一天可完成一類產(chǎn)品方法學開發(fā)，檢測后5分鐘完成清潔，12次運行只需6小時，比傳統(tǒng)CE-SDS平臺節(jié)省一半時間。Maurice讓流程更簡單，檢測過程如下圖所示：
Maurice C平臺則可快速進行蛋白制品等電點、電荷異質(zhì)性分析。類似Maurice S，Maurice C也具有流程簡化、無需額外管路系統(tǒng)、方法開發(fā)快、可追蹤實驗記錄等特點。類似ProteinSimple電荷異構(gòu)體分析儀iCE3，Maurice在等電聚焦后也采用非遷移全柱實時成像技術，在檢測流程和結(jié)果方面，與金標準iCE3 相比，Maurice C除保留相同分離度、分離時間、等電點檢測范圍等條件之外，還具有無需毛細管安裝、日常關機維護時間節(jié)省1小時、新增加蛋白自發(fā)熒光檢測模式(基于芳香族氨基酸自發(fā)熒光檢測)，從而提高檢測靈敏度等優(yōu)勢特點。
獨立的Maurice S或者Maurice C系統(tǒng)都可以升級為雙功能的Maurice系統(tǒng)，只需通過切換檢測卡盒(如下圖所示)，即可隨時實現(xiàn)對應的功能，每個批次運行后機器會自動清洗毛細管，兩功能切換間無需額外清洗毛細管、無需重啟機器。每個毛細管卡盒都具有RFID無線射頻識別標簽，便于追蹤使用針數(shù)和實驗后信息記錄。
Maurice系列的操作和分析軟件均使用界面友好、操作簡便的Compass軟件(同全自動蛋白表達分析系統(tǒng)Wes)，根據(jù)實時采集的信號可實現(xiàn)在線數(shù)據(jù)觀測，軟件處理的數(shù)據(jù)后續(xù)可兼容第三方軟件(Empower3等)進一步分析。
ICE和Maurice應用領域
1. 抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)共價修飾研究
研究報道了凍干蛋白質(zhì)上發(fā)生了一種獨特的化學修飾。當受到溫度脅迫時，冷凍干燥的單抗(mAb)和抗體 - 藥物偶聯(lián)物(ADC)可以在Glu，Asp，Thr和Ser氨基酸的側(cè)鏈上用緩沖液和賦形劑分子共價修飾。該反應主要通過常見緩沖液和賦形劑(例如組氨酸，三羥甲基氨基甲烷，海藻糖和蔗糖)與蛋白質(zhì)的序列中的Glu和Asp羧酸鹽的縮合而發(fā)生。研究還發(fā)現(xiàn)反應通過含有羧酸鹽的緩沖液(例如檸檬酸鹽)與蛋白質(zhì)的序列中的Thr和Ser羥基的縮合進行?；谠趩慰购虯DC上觀察到的共價結(jié)合物的質(zhì)量，顯示該反應生成水作為產(chǎn)物，因此有利于低水分環(huán)境，例如凍干蛋白質(zhì)。研究者提出了從固態(tài)的熱應激mAb和ADC的深度表征的案例研究中提取的蛋白質(zhì)的共價修飾的證據(jù)。另外，還展示了常見的電荷變異分析如成像毛細管等電聚焦和質(zhì)譜分析如何用于監(jiān)測這一特定類別的蛋白質(zhì)修飾。
參考文獻：Valliere-Douglass JF, Lewis P, Salas-Solano O, Jiang S. Solid-state mAbs and ADCs subjected to heat-stress stability conditions can be covalently modified with buffer and excipient molecules. J Pharm Sci. 2015 Feb;104(2):652-65. doi: 10.1002/jps.24276. Epub 2014 Dec 2.
2. 生物制品方法開發(fā)
毛細管等電聚焦(cIEF)通常在變性條件下使用尿素進行，以暴露可能有助于總電荷的任何埋藏的蛋白質(zhì)殘留物。然而尿素不會使一些蛋白質(zhì)完全變性，例如四聚酶Erwinia chrysanthemi L-天冬酰胺酶(ErA)，在這種情況下需要與電泳相容的替代變性劑。研究者采用烷基脲如N-乙基脲在cIEF期間作為變性劑。僅在8M尿素中的ErA的cIEF分析導致一組未分辨的峰，其等電點(pI值)在7.4至8.5的范圍內(nèi)。 2.0-2.2M N-乙基脲和8M尿素的組合提供了足夠的ErA變性，導致主峰具有7.3的pI值和7.0的酸性物質(zhì)次峰。蛋白質(zhì)殘留pKa值。還證明重組脫酰胺的ErA突變體遷移至與預測一致的pI值(對于一次脫酰胺，pI 7.0)。發(fā)現(xiàn)來自全規(guī)模制造(總峰面積的1.0-3.5%)的樣品中的ErA酸性物質(zhì)的定量是可再現(xiàn)的和線性的。在生物制藥測定開發(fā)過程中應考慮使用烷基脲作為毛細管電泳中的變性劑。
參考文獻：Gervais D, King D. Capillary isoelectric focusing of a difficult-to-denature tetrameric enzyme using alkylurea-urea mixtures. Anal Biochem. 2014 Nov 15;465:90-5. doi: 10.1016/j.ab.2014.08.004. Epub 2014 Aug 14.
3. 糖蛋白表征研究
毛細管電泳(CE)是一種用于表征糖蛋白的通用分析方法。研究者使用了幾種不同的CE分離模式，如CE-SDS凝膠，成像毛細管等電聚焦(icIEF)和毛細管區(qū)帶電泳(CZE)來研究治療性糖蛋白產(chǎn)品。 應用CE-SDS凝膠來表征聚糖占據(jù)和糖基化位點的數(shù)量，icIEF用于研究由糖蛋白中的唾液酸引起的電荷異質(zhì)性。 為了進一步表征糖蛋白，需要去除N-連接的聚糖，并采用CZE技術分析每個聚糖部分。文章給出了來自單克隆抗體，促紅細胞生成素和粒細胞集落刺激因子的實例，以證明這些CE模式的實用性。 另外，本文介紹了每種CE模式的樣品制備和分離條件的詳細信息。
參考文獻：Rustandi RR, Anderson C, Hamm M. Application of capillary electrophoresis in glycoprotein analysis. Methods Mol Biol. 2013;988:181-97. doi: 10.1007/978-1-62703-327-5_11.
4. icIEF在單克隆抗體藥領域的綜合評估
來自美國和瑞士的11家獨立生物制藥公司的12個實驗室成立的國際團隊，評估成像毛細管等電聚焦在單克隆抗體電荷異質(zhì)性分析中的穩(wěn)健性。不同的實驗室使用相同的毛細管等電聚焦測定法測定代表性單克隆抗體的表觀pI的相對分布。對于每個電荷異構(gòu)體峰產(chǎn)生的表觀pI數(shù)據(jù)在RSD值小于0.8%的實驗室之間顯示出非常好的精確度。類似地，使用不同分析人員，不同批次的兩性電解質(zhì)和多種儀器，不同實驗室的治療性單克隆抗體電荷異構(gòu)體百分比峰面積值的RSD小于11%。這些結(jié)果驗證了在生物制藥工業(yè)中成像毛細管等電聚焦的使用，用以支持治療性抗體的過程開發(fā)和監(jiān)管提交。
參考文獻：Salas-Solano O，et. Robustness of iCIEF methodology for the analysis of monoclonal antibodies: an interlaboratory study. J Sep Sci. 2012 Nov;35(22):3124-9. doi: 10.1002/jssc.201200633. Epub 2012 Oct 15.
5. 糖蛋白激素糖基化圖譜研究
重組人促紅細胞生成素(recombinant human erythropoietin，rhEPO)是一種糖蛋白激素，臨床上用于治療慢性腎病或化療引起的貧血癥?，F(xiàn)在全球有許多rhEPO的生物仿制藥陸續(xù)上市。基于rhEPO有著非常復雜的糖基化圖譜，而這些糖基化修飾對其生物活性有著至關重要的影響，所以需密切監(jiān)測rhEPO研發(fā)與質(zhì)控，以確保其與原研藥的一致性，安全性和有效性。在這篇文章中，研究者對來自11家中國和1家日本藥企生產(chǎn)的rhEPO制劑進行了比較：體內(nèi)生物活性的檢測以及通過唾液酸含量的測定，CE方法(iCIEF/iCE3)檢測電荷異構(gòu)體分布，AEX/HILICMS方法檢測O-糖譜圖和N-糖譜圖來探討rhEPO生物活性與其糖基化的關系。研究者觀察到這12種rhEPO的糖基化圖譜中出現(xiàn)唾液酸O-乙?；?，N-糖上N-聚乙酰乳糖胺單元的延伸，以及多天線結(jié)構(gòu)中唾液酸的分布等差異。一些樣品中N-糖上出現(xiàn)疑似5-和6-陰離子水平的升高與rhEPO的異構(gòu)體的酸性升高一致，這也可以通過體內(nèi)生物學活性的略微升高來反映。除此之外，這些糖基化圖譜的差異并沒有對小鼠體內(nèi)的生物學活性產(chǎn)生影響。盡管如此，隨著生物仿制藥的不斷出現(xiàn)，該研究強調(diào)了監(jiān)測生物制劑糖基化的重要性，從而對產(chǎn)品之間的差異性和異常糖基化的出現(xiàn)做出合理解釋。
參考文獻：Cowper B, Li X, Yu L, Zhou Y, Fan WH, Rao CM. Comprehensive glycan analysis of twelve recombinant human erythropoietin preparations from manufacturers in China and Japan. J Pharm Biomed Anal. 2018 May 10;153:214-220. doi: 10.1016/j.jpba.2018.02.043. Epub 2018 Feb 24.
6. 疫苗中載體蛋白滴度檢測
多糖蛋白為胸腺非依賴抗原，對于成人效果好，但是對于年齡小于2歲兒童效果差。因而多糖結(jié)合疫苗設計時，會將多糖抗原和載體蛋白共價結(jié)合，成為胸腺依賴性抗原，在兒童中獲取好的免疫效果。國外已批準上市的結(jié)合疫苗載體蛋白供5種：破傷風類毒素(TT)，白喉類毒素(DT)，白喉毒素無毒突變體(CRM197)，B群腦膜炎球菌外膜蛋白(OPM)和不可分型流感嗜血桿菌蛋白D(HiPD)。在細胞裂解液和純化樣本中檢測載體蛋白檢測載體蛋白等電點等，對于質(zhì)量控制非常重要，在國家藥典等權(quán)威文件中都有收錄。全球疫苗生產(chǎn)廠家Merck發(fā)表文章，評價Maurice和Wes組合使用，定量檢測疫苗中載體蛋白的等電點等。
icIEF的標準檢測是280 nm處的紫外吸光度，這限制了其在高蛋白質(zhì)濃度樣品和非復雜樣品中的應用。研究者描述了一個帶熒光檢測的icIEF儀器(Maurice)。證明了使用icIEF與熒光檢測及定量蛋白質(zhì)印跡來測量粗細胞裂解物和純化樣品中的白喉毒素突變體CRM197蛋白滴度的優(yōu)勢。 這兩種技術有很大的潛力成為分析粗細胞裂解液或其他復雜樣品類型中蛋白質(zhì)滴度的標準方法。
參考文獻：Loughney JW, Ha S, Rustandi RR. Quantitation of CRM197 using imaged capillary isoelectric focusing with fluorescence detection and capillary Western. Anal Biochem. 2017 Oct 1;534:19-23. doi: 10.1016/j.ab.2017.06.013. Epub 2017 Jun 27.
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